基因编辑

近年来,通过使用诸如锌指核酸酶 (ZFN)、转录激活因子样效应核酸酶 (TALEN) 和最近的 CRISPR/Cas9 系统等分子工具,基因编辑已经取得了进展。在对细胞系进行工程改造以实现最佳生物治疗生产时,这些技术在准确性和易用性方面取得了相当大的进步。

尽管取得了技术进步,但多步基因编辑工作流程仍然占用大量资源,包括:基因选择、PCR 扩增、DNA 提取、DNA 纯化、限制性内切酶消化、连接以及最终的插入验证。需要持续保持警惕,以免出现污染和下游复杂性。标准技术通常涉及多个纯化步骤,每个步骤都会导致大量产品损失。因此,需要使用大量高质量 DNA 来保证成功的细胞转化或转染。

颇尔的离心超滤设备可简化许多常见的核酸制备程序。可以在离心设备内进行质粒 DNA 和 DNA 扩增产物的限制性内切酶消化。可以对 DNA 构建体进行浓缩和脱盐,同时在 5 分钟的离心步骤中使引物和其他污染物进入废弃的滤液。将 DNA 片段连接到载体上也可以直接在超滤设备中完成,使产物可以转化为感受态细胞。减少不必要的样品转移和液体处理操作,可显著节省时间、人力和原材料。

核酸结合 (NAB) 产物提高了灵活性,降低了交叉污染的风险,并顺利实现了样品处理。NAB Nanosep® 离心设备结合了高结合力的创新双层玻璃纤维膜。这种过滤器可实现高质量和高产量,甚至可以回收从 50 bp 至 10000 bp 的片段,支持多个下游应用程序,同时无需处理额外的样品,从而节省时间和资源。

NAB 产品有 Nanosep® 单管旋转设备形式和高通量 AcroPrep™ Advance 96 孔过滤板形式。这种培养基让操作员可以在单一设备中灵活地纯化质粒 DNA (pDNA) 和基因 DNA (gDNA),或者总 RNA。

利用我们的超滤和纯化系统,简化基因编辑工作流程并简化库存订单。

细胞株构建

通过转化细菌细胞(如大肠杆菌)或转染酵母(如酿酒酵母)或哺乳动物细胞(如 CHO、HEK)进行有效的细胞株构建需要有效回收、浓缩和递送靶核酸片段。

用于转化或转染的小体积培养基的制备,需要氨基酸或抗生素变异的特异性细胞株构建体。无菌针头过滤器有助于在处理无法高压灭菌的小体积介质时保持无菌。颇尔实验室的 0.2 µm 无菌过滤器和囊氏滤器可确保有效过滤小批次或大批次的液体介质,以消除污染的风险。在将构建体引入细胞之前需要进一步浓缩的情况下,我们提供的一系列低分子量截留(3 至 1,000 kDa)超速离心设备和平板简化样品处理和制备流程。

细胞培养

通过细菌、酵母、昆虫或哺乳动物细胞培养物进行克隆和表达蛋白质带来了特殊的挑战。细胞培养中的无菌技术和无菌对于避免污染和下游复杂性至关重要。细胞培养物被污染会导致细胞健康不佳和细胞死亡、降低细胞系性能、减少产品产量,并丧失对提取样品完整性的信心。

在确保洁净或无菌培养条件之外,还需要对培养基和营养物质进行过滤灭菌,从而避免将污染物引入细胞培养环境。处理细胞系时还需要避免交叉污染,以确保结果的可重复性。

颇尔实验室 0.2 µm 的低蛋白结合率过滤介质可实现快速有效的过滤,以保持细胞培养应用的无菌性。从几毫升的小饲料体积到 100 升以上的容量,专有双层膜都能够对营养丰富的培养基和补充剂进行无菌过滤,同时确保有价值的营养不会流失。

我们的 0.1 µm Supor® 膜是一种固有的亲水性聚醚砜 (PES) 膜,可截留支原体,最大程度地防止用于细胞培养的血清或含血清培养基中出现支原体污染。

我们提供各种系列的直列式排气过滤器可确保进入细胞培养容器的空气和从容器中排出的气体无菌,同时防止液体进入真空泵等设备。

克隆筛选

可以通过传统方法筛选克隆,以鉴定携带所需基因组变化并表达目标蛋白的克隆,这些方法包括蛋白质印迹法、酶联免疫吸附测定法 (ELISA)、荧光激活细胞分选法 (FACS)、流式细胞术或利用高含量成像系统等。保持无菌性和克隆性对于目标蛋白的纯度和均一性很重要。尽可能快速筛选大量克隆,以选择有价值的克隆用于进一步分析至关重要。

在确保培养基和环境无菌的无菌过滤系统之外,颇尔实验室还提供各种离心设备和滤板,以简化蛋白质样品制备、gDNA 和 mRNA 纯化过程。AcroPrep™ Advanced 滤板旨在降低交叉污染的风险,并为样品处理和高通量筛选创造平稳的液体流动。我们的高灵敏度蛋白质结合膜专为蛋白质印迹等蛋白质检测分析应用而设计,背景噪音低,可提高结果的清晰度和灵敏度。固定化蛋白质可用于直接用于测序,提高工作流程的灵活性。

通过使用带有 30-40 µm PP/PE 培养基的 AcroPrep Advance 滤板制备样品,确保获得流式细胞术和细胞标记的清晰结果。这些滤板被设计用于捕获细胞聚集体,细胞聚集体会堵塞流动室,从而干扰工作流程并影响结果的清晰度。所有细胞标记和检测过程都可以在一个平板上进行(检测细胞表面抗原或细胞内蛋白质),无需在离心后进行抽吸,从而降低了产品损失的可能性。颇尔滤板可以通过真空或离心简单、快速、方便地去除、清洗或标记细胞。

组学分析样品制备

在鉴定表达目的蛋白的克隆后,需要进行克隆扩增、细胞收获、培养基收集和取样。通过高效的样品制备和纯化分析用生物分子来简化这些过程可以节省大量的时间和资源。从产量、纯度、稳定性、结构和功能等方面对表达的目标蛋白进行综合表征,对于选择合适的克隆进行进一步优化和扩大至关重要。为帮助进行这种测定,可以使用几种技术,包括第二代测序、免疫组织化学和质谱分析。

颇尔实验室的高性能深度过滤介质可有效去除细胞,并澄清细胞裂解物,滞留量低,提高产品回收率。

生物治疗药物中的污染物非常值得关注。内毒素是一种细菌毒性脂多糖 (LPS),可以通过质粒制剂和细菌蛋白表达引入。为避免毒性和对下游细胞检测的干扰,必须去除内毒素。虽然可以用 0.2 µm 的过滤器捕捉完整的细菌,但 LPS 要小得多,捕捉起来更具挑战性。去除带负电荷的 LPS 的有效方法就是使用带正电荷的基质。颇尔实验室提供带有 Mustang® E 膜的 Acrodisc® 装置,可有效去除内毒素。

我们的核酸结合离心设备简单易用并且具有创新性,结合双层玻璃纤维膜,提高产量和灵活性,可在单个设备中纯化基因组 DNA 和 mRNA,以支持多种下游应用。颇尔实验室核酸纯化解决方案无需使用不必要的空间,从而有效节省时间。自动化友好型的高通量 96 孔规格无需进行顺序样品制备,进一步提高工作流程的处理速度。

颇尔实验室提供高灵敏度的蛋白质结合膜,使用蛋白质印迹等技术,设计用于蛋白质检测分析。背景噪音低,可确保结果清晰、灵敏。固定化蛋白质可用于直接用于测序,提高工作流程的灵活性。