基因治疗病毒载体上游生产工艺

病毒载体是生物制药行业用于传递遗传物质进行治疗的实用工具。近年来，基因治疗的临床前开发和临床研究应用已大量增加，旨在实现新型疗法的商业化。近日的新冠疫情也将病毒载体疫苗的研究推向热议话题，病毒载体的广泛应用以及规模化生产越来越引起业内关注。为了满足工业界对各种用途的对大量符合GMP要求的治疗用病毒载体的需求，必须生产出可以有效表达和纯化的高品质可靠的产品，用于临床研究。

上游病毒载体生产由多种单元操作构成，例如细胞扩增、载体细胞的转染或感染以及病毒载体生产。每个单元操作都包含大量变量，例如细胞/病毒培养平台、细胞系、培养基配方和生物过程参数（温度、pH值和溶氧），它们会影响最终病毒载体的生产能力。

由于没有适用于所有治疗应用的通用平台或工艺，因此每种药品都应该在早期开发过程中就选择病毒、细胞系和生物工艺系统。另外，在药物开发过程中要考虑多种重要因素，例如开发时间表、产品成本、产品产量、上市时间以及工艺稳定性等。

当前有两种广泛使用的首选病毒载体生产方式。多数研究者采用瞬时转染，或者在哺乳动物或昆虫细胞中获得稳定的生产细胞系。

大部分瞬时转染载体的生产使用贴壁性细胞系，其中所选细胞类型需要有利于它们附着、生长和生产病毒载体的表面。另一方面，稳定生产的细胞系通常是适应悬浮的细胞系，不需要基质附着、生长和生产病毒载体。

这两种病毒载体生产方式各有优缺点。因此，需要在临床开发的早期就要确定目标剂量和患者群体，以指导选择最优载体生产平台，从而满足未来的商业化需求。

瞬时转染涉及将遗传物质插入细胞中，而不需要将遗传物质整合到宿主细胞基因组中，该过程在操作上相对简单和直接。它还受益于以下因素：转染的遗传物质在细胞内停留的时间有限，并且不会转移至其他新的分裂细胞中。采用该工艺生产的病毒载体在转染后较短时间内就可以从细胞中收获。

与稳定的生产细胞系相比，基于瞬时转染的病毒生产相关的工艺开发时间相对较短。生物制药行业已经有多家成熟的供应商，拥有高效瞬时转染类载体生产需要的各种工具。但是，使用稳定的生产细胞系的载体生产方法还相对较新，并且正在进行支持行业不断增长的需求的工作。

瞬时转染是一种非常灵活和高效的病毒载体生产方法，它可以缩短开发时间并加速上市时间。但是，它需要昂贵的GMP级质粒用于转染步骤，以及用于清除辅助质粒、细胞DNA和转染试剂的其他纯化步骤。

通过增加培养系统的数量（横向放大）或者顺序使用更大的设备（纵向放大），可以实现工业规模的病毒载体生产。

迄今为止，多数载体生产都使用细胞工厂、滚瓶、HyperFlask和HyperStack等完成，这些生产平台都需要增加培养单元的数量，以实现大规模生产。该方法是费时的，劳动密集的、昂贵的并且需要较大的占地空间。

生物反应器有助于贴壁细胞生产病毒载体的纵向放大，相对于横向放大有许多优点。这些生产优点包括：

• 易于监控

• 减少单元操作次数

• 减少敞口操作避免污染风险

• 降低运营成本

• 控制生物反应器内环境-可以提高生产率以及最终产品的质量

中空纤维生物反应器（例如Quantum）和固定床生物反应器（例如颇尔iCELLis生物反应器）可以增大规模，并且在生产规模条件下能提供多种放大规模。除增加可放大性外，iCELLis生物反应器平台还可培养更高的单位体积细胞密度，并且与传统贴壁培养相比能表达相似的细胞特异性滴度。与以前的横向放大相比，尽管固定床和中空纤维生物反应器具有明显的纵向放大优优势，但目前的规模仍限于500m²。如果治疗产品的剂量效价或商业需求超过当前的每批生产量，则工艺过程将需要横向放大至更大的表面积。

微载体平台也可以为贴壁细胞扩增提供各种纵向放大选项，能够满足研究、临床和生产规模所需要的载体生产量。疫苗行业已使用微载体和搅拌罐生物反应器成功地将病毒生产规模纵向放大到≥2000L。例如，以10cm²/mL的微载体密度为例，2000L搅拌罐生物反应器可提供2000m²的表面积。采用微载体平台用于载体生产的潜在缺点是，对于某些系统而言，优化细胞贴附、生长和转染效率的开发研究可能是漫长的。

稳转细胞系经过基因修饰，通过诱导型启动子表达辅助基因、包装基因以及目标基因，用于生产病毒载体。稳转细胞系可以通过避免多质粒转染步骤简化病毒载体生产步骤，通过避免使用昂贵的cGMP质粒降低成本，通过生成历史清晰的细胞系最大程度地降低管控要求。

当前已获批或处于临床阶段后期的基因疗法，主要聚焦于治疗罕见的遗传疾病，其中目标患者人群数和每剂量的病毒颗粒的需求量相对较小。但是，老年痴呆症、帕金森症、类风湿性关节炎和血友病等疾病治疗的商业化面临巨大生产挑战，这是因为每剂量的病毒颗粒数会显著增加（对数级），并且患者人数也会更多。治疗此类疾病需要更多的病毒剂量和更高的病毒滴度，预计稳转细胞系的开发会显著提高病毒载体生产能力，满足这些疗法所需要的条件和规格。

稳转细胞系的开发可能需要较长的时间，这会增加上市时间。但是，一旦该细胞系经过工程改造和克隆可以达到更高的细胞密度和病毒载体滴度，该工艺最终会实现更高的生产效率并具备可扩展性。

许多公司正在积极开发设计人源细胞系，使其适合在悬浮培养的无血清培养基中生长。希望向稳定的人源生产细胞系的转变将减少管控安全问题，并通过提供糖基化修饰方式提高病毒载体在人体内的稳定性。

病毒载体领域的研究者正在探索使用悬浮细胞系进行基于瞬时转染的病毒载体生产。将贴壁培养的细胞系调整为悬浮培养方法会增加工艺开发时间，但是，一旦筛选出最佳细胞株，将不再需要用于细胞贴壁培养的基质。

相对比贴壁细胞培养，悬浮细胞培养具有大量优点，包括：

• 易于从实验室规模的摇瓶或转瓶平台放大至生物反应器规模，不需要细胞附着和解离。

• 使用化学成分确定的或无血清培养基中培养时，用于载体生产的各种HEK293细胞系将更容易从贴壁培养驯化为为悬浮培养。

• 使用不含动物成分的培养基进行培养可以减少下游纯化步骤，降低外源试剂相关管控风险，从而增加生产时的优势。

搅拌式生物反应器在业内用于商业化生产重组蛋白和单克隆抗体已长达几十年，这些反应器具有许多优点，包括：

• 该技术已为工业化生产所采用，并已针对生物制剂的生产进行了优化。

• 该平台生产的许多药物已被全球监管机构批准使用。

• 已证明可放大至大规模生产。

如颇尔（Pall）的Allegro™ STR生物反应器系列应用于多种细胞系的悬浮应用领域，典型应用包括：

• 哺乳动物细胞悬浮培养，如CHO或HEK293细胞

• 昆虫细胞培养，如Sf9细胞

• 悬浮细胞分批和补料分批培养

• 贴壁细胞的微载体化培养，如Vero