基因及细胞治疗系列在线研讨会回看

亦诺微首个溶瘤病毒药物申报过程回顾及法规解读

 

 

膜分离技术在病毒载体下游工艺中的应用与病毒载体澄清工艺策略

 

颇尔中国区技术经理王静分享了“病毒载体澄清工艺策略”,颇尔中国区技术经理李涛分享了“膜分离技术在病毒载体下游工艺中的应用”,为大家带来了病毒载体下游工艺策略。

 

 

病毒载体澄清工艺策略

 

 

 

病毒载体下游工艺多而繁琐,每一个工艺步骤都会对下一步产生影响,澄清是一个承上启下的关键工艺点,那澄清的关键因素和澄清产品类型的选择都是至关重要的。本部分内容着重讨论病毒载体下游工艺中影响澄清工艺选择的因素以及一些案例分享

 

 

精彩答疑

 

提问1:在澄清操作中,有什么点需要注意吗,比如温度控制,顶洗缓冲液的选择,添加剂,等等,从处理澄清滤器以外的其他方面考虑提高病毒回收率等。

 

王静:有些病毒是比较敏感的,尤其一些带包膜的病毒,对温度,剪切,压力都比较敏感。因此在工艺中要充分了解,避免整个工艺过程中样品失活而造成回收率降低。在操作方面,避免出现较大压差,可以在小试环节分段取样,了解过滤过程中滴度的变化情况,一些大病毒在滤器堵塞后会被截留在膜孔中,虽然澄清度还是良好的,但是损失了很多病毒。过滤后的冲洗回收是很重要的,可以选择适当的缓冲液对滤器进行冲洗,将残留在膜上的病毒冲洗出来,可以选择层析的上样buffer,含有一定的盐容易提高回收率。

 

提问2:能解释下TFF在病毒工艺中叫微滤浓缩(抗体中叫超滤浓缩)的原因,是因为它用的膜孔径大吗? 

 

王静:TFF是Tangential flow filtration的缩写,是指切向流过滤。是相对于直流过滤来说的另一种过滤形式。而微滤和超滤是对于孔径的区分,通常>0.1um的称作微滤,<0.1um又大于纳米级别的称作超滤,更精细的过滤还有纳滤,反渗透等。至于浓缩以及缓冲液置换是切向流过滤可以实现的功能。

 

提问3:用293F悬浮体系包装aav,用pdk系列比如pdk11澄清后目视液体较澄清,衣壳滴度1*10E11,但后面核酸酶除宿主dna后,用tff洗滤后成了浑浊的像浓豆浆类似的液体是怎么回事?是其中hcp含量非常高吗? 

 

王静:这个问题比较复杂,涉及到澄清以及超滤两个工艺点,首先应该排除澄清工艺是否有问题,从样品外观来看是正常的,也可以通过检测滴度,杂质等进行确认。超滤工艺中发生混浊的原因比较多,一方面可能是由于过度浓缩样品聚集,另外也可能是缓冲体系变化导致部分蛋白析出,也有可能是工艺控制出现问题,比如过高的剪切力或者跨膜压导致样品发生变化。可以考虑调整缓冲体系添加保护剂,或者严格控制超滤工艺等方式予以改善。

 

膜分离技术在病毒载体下游工艺中的应用

 

 

 

李涛老师的讲座内容主要包含以下3部分:

  • 切向流过滤技术在病毒载体下游纯化中的应用

  • 膜层析技术在病毒载体下游纯化中的应用

  • 除菌过滤在病毒载体下游纯化中的应用

 

与基因治疗产品密切相关的病毒载体制备下游工艺,可否能像单抗下游工艺开发、放大模式,应用切向流过滤、直流过滤、膜层析等基于膜分离技术的产品,实现工艺的开发与放大?李涛老师在本部分为大家带来基于膜分离技术对于病毒载体下游纯化工艺的应用分享。并且颇尔作为膜分离技术与产品的多年从业者,在膜分离纯化工艺中具有丰富经验。

 

 

精彩答疑

 

提问1:膜层析相较于柱层析优点这么多,想问下它的再生性如何,可重复利用吗?可用几次?如何衡量其能不能再次使用?

 

李涛:Pall有两条膜层析产品线分别是一次性应用的mutang Q和可重复使用的mustang Q XT。mustang Q xt产品的使用寿命需要根据客户的料液,以及使用的工艺点,在小规模条件下做重复测试,确定其使用寿命。类似填料介质的寿命验证流程。使用寿命的判定也有客户决定,例如载量的衰减,层析收集样品的纯度下降,累计批次工艺过程中操作压力的升高,回收率的下降等指标。

 

提问2:是不是层析填料有电荷或者基团,膜没有?

 

李涛:膜层析产品也是有电荷官能团的。

 

提问3:腺病毒收获澄清后的样品超滤,进口压,跨膜压有没有特殊的控制需求?透过端需不需要加背压呢?

 

李涛:一般推荐进口流速是5升每分钟每平米,应用omega T 300kd膜包,跨膜压控制不高,在4-10psi。透过端需要背压。

第一场——亦诺微首个溶瘤病毒药物申报过程回顾及法规解读

主题一:溶瘤病毒申报药物MVR-T3011 研究回顾及进展

倪东耀 深圳市亦诺微医药科技有限公司 首席研发官

 

主题二:基因及细胞治疗产品研究与应用法规概览

赵飞 颇尔高级科学事务经理

第二场——基因治疗病毒载体上游工艺从研发平台到生产制造的机遇与挑战

主题一:从研发平台到生产制造——基因治疗的机遇与挑战

吕静 颇尔商务拓展经理

 

主题二:病毒载体上游工艺

曲丽丽 颇尔反应器应用专家

第四场——一次性技术在生物制药行业中的应用及一次性使用技术工艺验证

主题一:一次性技术在生物制药行业中的应用

罗姣 颇尔Single Use项目工程师

 

主题二:一次性使用技术的工艺验证

李小香 颇尔SUT验证实验室经理

400-675-2228

颇尔咨询热线

基因治疗整体解决方案

病毒载体生产的工业化解决方案

   

 

 

上游病毒载体生产

 

上游病毒载体生产由多种单元操作构成,例如细胞扩增、载体细胞的转染或感染以及病毒载体生产。每个单元操作都包含大量变量,例如细胞/病毒培养平台、细胞系、培养基配方和生物过程参数(温度、pH值和溶氧),它们会影响最终病毒载体的生产能力。

 

 

 

病毒载体纯化

 

稳健的,可放大的纯化技术方案可以有效的减少诸如残留质粒DNA、宿主细胞DNA以及不含有目的基因载体等杂质,制备出高纯度、高浓度且满足需求的病毒载体。

 

 

 

 

一次性配储液

 

培养基、缓冲液、中间体和终产品的制备、储存以及转移,这些过程都需要小心控制,避免污染且需要符合cGMP要求。操作过程中应用一次性系统的高效体现在完好的数据记录以及加速工艺开发进程,简化生产工艺和保障产品质量。