欧洲肠外科学杂志
Rolf Jaenchen, Jörg Schubert, Sima Jafari and Alison West
本文基于最初发表在《欧洲肠外科学杂志》（European Journal of Parenteral Sciences），1997, Vol. 2, No. 2, 39–45.
总结
目前，在原位对无菌空气过滤器进行完整性试验的需求越来越大。水侵入试验（WIT）优于现有方法，但其背后的科学根据尚不太清楚。本研究调查了测量的对象，并提供了影响试验因素的数据，清楚地展示了测试完整过滤器时蒸发流的作用，并量化了水质和温度的影响。对试验科学根据的更好理解使得影响试验的因素能够得到控制，并能与后续的细菌挑战建立可靠关联。
简介
疏水性杀菌级薄膜过滤器在制药工业中广泛用于气体过滤有水时过滤器的润湿将导致高压降，疏水性对于防止这种情况来说非常必要。疏水性对完整性试验的实用性也有非常大的影响。传统的薄膜过滤器完整性试验方法，例如正向流动试验和起泡点试验，都需要过滤膜完全润湿。对于疏水性过滤器，需要使用有机溶剂，通常是异丙醇（IPA）。
使用这些溶剂会带来某些必须考虑的限制。在许多情况下，这导致过滤器“离线”进行测试，需要从生产线上拆下完整的组件或滤芯，并且在溶剂处理更容易管理的生产区域执行完整性试验。这种方法的主要局限性在于，滤芯与外壳之间的密封可能不会被测试，存在重新安装不正确的可能性，并且在使用之前对蒸汽灭菌的组件进行测试需要无菌操作。因此，对可以原位进行的完整性试验的需求日益增加，并且不需要使用有机溶剂。
水侵入试验有可能符合这些要求。上游水基试验是一个很好的选择，因为它无污染，不需要使用酒精，而是使用不易燃的试液，不需要下游操作。孔径分布测定的入侵试验于1921年问世1，并于1954年应用于薄膜过滤器2。这些试验使用了汞，因此不适合生产中的外部试验。1980年报告第一次用水作为试验液体进行试验3。该试验是平板过滤膜的总故障试验，并且与细菌去除无关。
1990年，人们提出了将水侵入测量与疏水膜滤器的细菌挑战联系起来的第一次尝试4。所述试验仍然基于以下理论，即加压水缓慢侵入完整疏水膜的基质中，在中等压力下也可以在上游侧作为微小的体积变化测量出来。损坏的过滤器会由于水通过膜而出现更大的体积变化，以便于通过试验区分过滤器是否通过细菌挑战试验。
根据这个理论，可以预测，完整的过滤器不会显示有水进入膜的基质，并会在一段时间的试验之后体积变化接近于零。然而，这与其他观察结果相冲突，这些观察结果清楚地表明，随着时间的延长，体积变化很小但是持续不断。这对水侵入试验的科学根据带来了一定程度的不确定性，阻碍了一些潜在用户的使用。
自动化的压力衰减完整性试验仪器，如Sartorius的Sartocheck 3和Millipore的Integritest Exacta，结合了疏水过滤器水基完整性试验的各种选项。在这些仪器中，压力衰减是在固定的时间段内测量的。然后，该值自动转换为计算的平均流量，并作为试验结果报告。在整个试验过程中，用于连续测量流量的先进直接流量测量仪器（例如Palltronic® TruFlow和Flowstar,）使进一步的研究能够进行，以研究试验的理论基础。本文研究了采用直接流量测量的水侵入试验的理论基础以及水质和温度等因素的影响。
材料和方法
1. 过滤器总成
图1显示了这些研究中使用的试验系统。所有试验均采用新型干式颇尔Emflon® PFR筒式过滤器，该滤芯采用颇尔不锈钢外壳（部件号SASM011）和长25 cm的疏水性PTFE膜（部件号AB1PFR7PVH4），由英国朴茨茅斯的颇尔欧洲有限公司供货。原则上，该试验系统可用于任何消毒级疏水薄膜过滤器。
图1：用于水侵入试验的系统
注：A）基本系统
B）安装气相和水相之间的胶乳屏障
C）安装在过滤器下游的冷阱
D）安装在过滤器下游的滴定管
对于具体的试验，系统被修改为图1B和1C所示。图1B显示了乳胶屏障的安装。在注水之后、加压系统之前，将一个乳胶气球放置在壳体的顶部，即可安装这个屏障。该屏障将水相与气相分离。
在图1C中，所示的两个冷阱（冰浴）安装在过滤器外壳的出口处。第一个冷阱用于收集通过过滤器的水，第二个冷阱用于排除来自环境的水蒸气。在图1D中，一个滴定管连接到过滤器总成的下游侧，测量任何跨膜流移动的气体的体积。
2. 流量测量仪
图1所示的流量测量仪是Palltronic Flowstar或Palltronic Truflow（颇尔欧洲有限公司，英国朴茨茅斯）。这些装置对上游侧的系统加压并测量保持该压力所需的进入系统的流量。
3. 水
除非另有说明，否则使用电导率为2-3 μS/cm-1的去离子水。对于用空气饱和的水进行的试验，使空气泡通过水30分钟来制备该水。脱气水是在使用前将水煮沸，然后在密封的容器中冷却制成的。使用WTW LF90/KLE1（WTW，德国魏尔海姆）的电导率探头测量水的电导率。
4. 温度
在试验过程中，水和环境的温度为20℃。要在更高或更低温度下进行测量，将图1A中给出的过滤器总成安装在温度受控的室内，在水和环境温度相等时开始试验。压力对通过疏水过滤器的水流的影响。在这项研究中，上游流量是针对一定范围的施加压力进行测量的。结果如图2所示。
结果
压力对疏水过滤器水流的影响
在这项研究中，上游流量是针对一定范围的施加压力进行测量的。结果如图2所示。
图2：流量作为压力的函数
在低压下，记录了一个较小的可测量的流量。这个稳定的流量随着压力的增加而增加在5.5-6.0 bar的范围内，流量迅速增加。这种非线性增加与通过膜的较大孔隙的水漏过相吻合。在这个突破区以下的压力相关流量必定与另一个机制有关。由于在这个压力范围的下限（通常为1.8-2.5 bar）进行水侵入试验，必须了解所测量流量的基础和影响因素。因此，通过后续研究对此进一步进行调查。
一段时间的流量测量
在过滤器上游侧测量的流量可以通过许多效应来解释。当考虑到试验过程的变化时，可以更清楚地理解这些效应。加压是通过引入压缩空气来实现的。这会导致（1）褶皱过滤器结构的压缩；（2）膜褶皱中的空气排出；（3）压缩加热（绝热效应）后气体顶部空间的冷却；（4）水侵入膜结构；（5）气体溶入水中，以及（6）水流过膜。以上游流量作为时间的函数进行测量，以评估这些效应。结果如图3所示。
在试验的早期阶段，流量相对较高，上述（1）到（6）的所有因素都可能在这个阶段出现。但是，大约20分钟后流量稳定，然后保持恒定。这个结果和其他长时间研究表明，完整过滤器在初始稳定期后具有恒定、可测量的流量。这个测量不能用上述因素（1）到（4）的瞬时效应来解释，因为它们会随着时间减少到零。因此，我们通过进一步的研究来评估这种流动是否与气体转移到水中或水通过膜相关联。
过滤器上游和下游流量对比
水侵入试验在过滤器的上游侧进行，其基本问题之一在于过滤器上游侧测量的稳定流量是否直接来自通过过滤器的流动。为了对此进行测试，在下游侧安装一个滴定管，以测量过滤器下游侧的位移体积，并将其与上游侧的流量测量装置的结果进行比较。表1中总结的结果表明，在上游侧测量的流量与通过过滤膜的体积转移直接相关。
气/液界面不透气屏障和水曝气对流量的影响
研究表明，透过过滤膜流动的机制可能是加压气体溶解到试液中，扩散进入并通过液体，穿过膜到达过滤器的下游侧。这种气体转移可以解释测量的流量。为了评估气体转移到液相中对测量流量的影响，在试液和气体顶部空间之间放置了不可渗透的乳胶屏障。带屏障的流量测量结果与没有屏障的相同过滤器的结果进行比较。表2总结了这项研究的结果。
结果表明，屏障对测量的流量没有影响。如果一个完整过滤器的背景流量主要是由于气体向下游侧的溶解和转移造成的，那么在屏障就位的情况下，预期流量的大幅减少。通过比较充气和除气水的效果，进行进一步的研究，以评估气体通过液相时可能的转移。
如果背景流量与气体溶解有关，则两种试液之间的水侵入流量会有显著差异。表3给出了水侵入试验结果，表明稳定后的曝气水平对流量没有显著影响。
这些数据与使用不可渗透屏障所获得的结果一致，并且表明气体在水相中的任何溶解对完整过滤器的测量流量没有显著影响。因此，测得的流量主要是由于通过膜的蒸汽或液相中的水。
下游侧水的检测
对于25 cm长度的过滤器，稳定之后在完整过滤器上测量的上游流量通常为0.2至0.3 mL/分钟。而且，在试验过程中，下游侧通常不会观察到游离水。为了确定下游水是否存在，有必要确保游离水和水蒸气以受控的方式收集。这是使用图1C所示的设备进行的。在完整的过滤器上进行水侵入试验。
由于流量低，有必要将试验时间延长到300分钟，以在下游收集大量的水。使用饮用水（即不去离子）进行的初步试验表明，下游收集的水比上游电导率低。这提示了一种可能的机制，涉及气相流过膜。为了进一步测试该理论，使用具有高电导率的0.2%氯化钠溶液作为试液并重复实验。结果如表4所示。
下游收集水的电导率比氯化钠溶液低得多，表明通过膜的是水分子，而不是氯化钠离子。这些结果支持这样的理论，即完整过滤器的稳定流动主要是由于膜内水分蒸发以及气相流过膜流向下游侧。
该过程导致上游侧的水量损失，这一损失可以在恒定的压力条件下作为上游侧的流量来测量。下游收集水的电导率高于纯凝结水的电导率。这可以用离子污染物对下游系统的影响来解释。
水的离子含量对测量流量的影响
以前的调查5显示了水质和测量流量之间的关系。因此，通过进一步研究确认这种关系的可能原因。通过向水中加入氯化钠来获得具有大范围电导率的液体，从而在相同的过滤器上进行一系列的试验。结果如表5所示。还测量了试液的表面张力，以确保这不是一个影响因素。
结果证实，水的离子含量对测量流量具有显著影响。增加离子浓度和电导率会降低流量。可以预料的是，一个完整过滤器的测量流量主要是由于蒸发，因为较高的离子浓度会导致较低的蒸发量。如果液态水的流动是主要机制，则这是不可预料的。这项研究也显示出了控制常规试验所用水的质量的重要性。首选纯化水或注射用水形式的去离子水，因为它容易获得且适合于药物使用。
水温对测量流量的影响
从早期的出版物来看，水温对水侵入试验的影响尚不清楚。1990年（4）的研究显示，随着温度的升高，流量减少，而其他研究（6）则显示，随着温度的升高，流量增加。试验在不同的温度下进行，但试验条件为环境温度与水温相等的条件。这样就消除了环境温度的任何影响。这些研究的结果总结在图4中。
数据显示，流量随着温度的增加。这为支持完整过滤器的蒸发机制提供了进一步的证据，因为蒸发速率会随着温度的升高而增加。结果还表明，在确定水侵入试验的试验参数时，必须考虑水温。
讨论
对于水侵入试验期间在完整过滤器的上游侧观察到的流动，之前已经提出了两种解释：水侵入膜结构4和褶皱压缩7。
在初始加压阶段，水可能会在一定程度上渗入膜结构，但预计会在短时间内结束。测得的流量将变为零。实际上这不会发生，因此侵入膜结构不能解释随着时间的延长测量的连续和稳定的流动。
在试验的初始稳定阶段期间，由于进行试验时的高压差，会发生褶皱压缩。压缩作为上游的流动被检测出来。但是，当已经达到完全压缩时，这个过程最终会停止。因此，压缩效应不能解释稳定后观察到的连续、恒定的流动。
本文给出的数据支持以下理论，即完整过滤器上游侧的连续可测流量主要是由于水透过膜的蒸发造成的。当疏水过滤器被水覆盖并且水被加压时，膜内会发生蒸发。产生的蒸汽将通过膜到达过滤器的下游侧。这会导致水流从上游侧流失，这可以通过流量测量仪器来测量。
以下结果支持这一理论。首先，过滤器下游收集的水的电导率大大低于上游侧水的电导率。如果流动主要是由于液体流过膜的较大孔隙，则情况将并非如此。
其次，试液的离子含量对流量有很大的影响。流量随着离子浓度的增加而降低。由于已知蒸发随着离子浓度的增加而减少，这支持了主要流量机制基于蒸发的理论。
第三，水温对流量有直接的影响。流量随温度升高而增加。由于蒸发速率也会随着温度的升高而增加，这与蒸发机制是一致的。本研究中的结果解释了为什么完整过滤器在通过水侵入试验测试时显示出较小的可测量的流量。对于孔隙过大的过滤器，由于液态水直接流过膜，所以会显示出更大的流量。
对试验科学根据的更好理解使得影响试验的因素能够得到控制，并且能够针对破坏性细菌挑战试验建立可靠关联8、9。
另外，还有关于如何在生产环境中进行试验的实用指南9。
结论
这项研究消除了关于水侵入试验科学根据的不确定性，清楚地证明了蒸发流在完整过滤器中的作用，并且确定了影响试验的其他因素。最新的流量测量仪器可以准确测量与水侵入试验相关的低流量。通过在受控条件下使用经过适当验证的试验设备，水侵入试验可用作疏水过滤器的可靠完整性试验。
参考文献
1Washburn, F.W. ; Note on a Method of Determining the Distribution of Pore Sizes in a Porous Material, Proc. Natl. Acad. SCI, Vol 7, 1921, pp. 115 - 116 (1921).
2Honald E, and Shau E ; Application of mercury-intrusion method for determination of pore size distribution to membrane filters, Science, Vol 120, p 805 (1954).
3Sciences, Filtration Catalogue and System Design Guide (1980).
4Dosmar et al, The Water Pressure Integrity Test: a new Integrity Test for Hydrophobic Membrane Filters. Journal of Parenteral Science and Technology Vol 46 (4) pp. 102 - 106 (1990).
5Analysis of water penetration through hydrophobic filters. Pall Publication STR 1427, 1994.
6Dosmar et al, A new in-place integrity test for hydophobic membrane filters, Filtration & Separation, 30 (4) p. 305 - 309 (1993).
7Tingley et al, Water-Flow integrity testing: A viable and validatable alternative to alcohol testing, PDA Asian Symposium (1994).
8Emflon PFR validation guide, Pall Publication STR 1576, 1996.
9The Pall Water Intrusion Test for Integrity Testing Sterile Gas Filters. Pall Publication STR 1603, 1997.