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病毒载体生产的上游生物工艺

2019年9月27日

 

病毒载体是生物制药行业用于传递遗传物质进行治疗的实用工具。近年来,基因治疗的临床前开发和临床研究应用已大量增加,旨在实现新型疗法的商业化。为了满足工业界对各种用途的对大量符合GMP要求的治疗用病毒载体的需求,必须生产出可以有效表达和纯化的高品质可靠的产品,用于临床研究。

 

在本博客中,我们将聚焦讨论载体生产过程中上游生物工艺涉及的关键要素和技术。

 

上游病毒载体生产由多种单元操作构成,例如细胞扩增、载体细胞的转染或感染以及病毒载体生产。每个单元操作都包含大量变量,例如细胞/病毒培养平台、细胞系、培养基配方和生物过程参数(温度、pH值和溶解氧),它们会影响最终病毒载体的生产能力。

 

由于没有适用于所有治疗应用的通用平台或工艺,因此每种药品都应该在早期开发过程中就选择病毒、细胞系和生物工艺系统。另外,在药物开发过程中要考虑多种重要因素,例如开发时间表、产品成本、产品产量、上市时间以及工艺稳定性等。

 

当前有两种广泛使用的首选病毒载体生产方式。多数研究者采用瞬时转染,或者在哺乳动物或昆虫细胞中获得稳定的生产细胞系。

 

大部分瞬时转染载体的生产使用贴壁依赖性细胞系,其中所选细胞类型需要有利于它们附着、生长和生产病毒载体的表面。另一方面,稳定生产的细胞系通常是适应悬浮的细胞系,不需要基质附着、生长和生产病毒载体。

 

这两种病毒载体生产方式各有优缺点。因此,需要在临床开发的早期就要确定目标剂量和患者群体,以指导选择最优载体生产平台,从而满足未来的商业化需求。

 

瞬时转染

 

瞬时转染涉及将遗传物质插入细胞中,而不需要将遗传物质整合到宿主细胞基因组中,该过程在操作上相对简单和直接。它还受益于以下因素:转染的遗传物质在细胞内停留的时间有限,并且不会转移至其他新的分裂细胞中。采用该工艺生产的病毒载体在转染后较短时间内就可以从细胞中收获。

 

与稳定的生产细胞系相比,基于瞬时转染的病毒生产相关的工艺开发时间相对较短。生物制药行业已经有多家成熟的供应商,拥有高效瞬时转染类载体生产需要的各种工具。但是,使用稳定的生产细胞系的载体生产方法还相对较新,并且正在进行支持行业不断增长的需求的工作。

 

瞬时转染是一种非常灵活和高效的病毒载体生产方法,它可以缩短开发时间并加速上市时间。但是,它需要昂贵的GMP级质粒用于转染步骤,以及用于清除辅助质粒、细胞DNA和转染试剂的其他纯化步骤。

 

贴壁细胞放大工艺用于载体生产

 

通过增加培养系统的数量(横向放大)或者顺序使用更大的设备(纵向放大),可以实现工业规模的病毒载体生产。

 

迄今为止,多数载体生产都使用细胞工厂、滚瓶、HyperFlask和HyperStack等完成,这些生产平台都需要增加培养单元的数量,以实现大规模生产。该方法是费时的,劳动密集的、昂贵的并且需要较大的占地空间。

 

生物反应器有助于贴壁细胞生产病毒载体的纵向放大,相对于横向放大有许多优点。这些生产优点包括:

 

  • 易于监控
  • 减少单元操作次数
  • 减少敞口操作避免污染风险
  • 降低运营成本
  • 控制生物反应器内环境-可以提高生产率以及最终产品的质量

 

中空纤维生物反应器(例如Quantum)和固定床生物反应器(例如颇尔(Pall)iCELLis®生物反应器)可以增大规模,并且在生产规模条件下能提供多种放大规模。除增加可放大性外,iCELLis生物反应器平台还可培养更高的单位体积细胞密度,并且与传统贴壁培养相比能表达相似的细胞特异性滴度。与以前的横向放大相比,尽管固定床和中空纤维生物反应器具有明显的纵向放大优优势,但目前的规模仍限于500m2。如果治疗产品的剂量效价或商业需求超过当前的每批生产量,则工艺过程将需要纵向放大至更大的表面积。

 

微载体平台也可以为贴壁细胞扩增提供各种纵向放大选项,能够满足研究、临床和生产规模所需要的载体生产量。疫苗行业已使用微载体和搅拌罐生物反应器成功地将病毒生产规模纵向放大到≥2000L。例如,以10cm2/mL的微载体密度为例,2000L搅拌罐生物反应器可提供2000m2的表面积。采用微载体平台用于载体生产的潜在缺点是,对于某些系统而言,优化细胞贴附、生长和转染效率的开发研究可能是漫长的。

 

欢迎阅读下周博客的更多信息,我们将继续讨论病毒载体生产的上游生物工艺”(第2部分/共2部分)

 

References:

 

  1. https://insights.bio/cell-and-gene-therapy-insights/wp-content/uploads/2019/04/Ankita-Desai-Philipp-Nold-Interview.pdf
  2. https://labiotech.eu/sponsored/producing-adeno-associated-virus-vectors-cevec/
  3. https://www.pharmasalmanac.com/articles/transient-transfection-at-a-large-scale-for-flexibility-in-clinical-and-commercial-vector-manufacturing
  4. Closing the production gap in gene therapy - A scalable helper virus-free AAV production platform webinar – 11 July 2019 - https://insights.bio/cell-and-gene-therapy-insights
  5. Key consideration in Gene Therapy manufacturing for commercialization – Cell culture DISH https://cellculturedish.com/wp-content/uploads/2018/09/Key-Considerations-Gen-Therapy-Manufacturing-Commercialization.pdf

 

HyperFlasks和HyperStacks是Corning公司的商标,Quantum是Terumo公司的商标。

Upstream Bioprocessing for Manufacturing Viral Vectors

Grishma Patel – 工艺开发业务高级科学家

Grishma Patel是颇尔(Pall)生物技术的工艺开发业务(PDS)团队的高级科学家。她拥有细胞分子与生物学理学硕士学位,在贴壁细胞培养工艺放大领域拥有10多年的经验。在闲暇时间,Grishma乐于与家人共度时光、玩棋盘游戏和旅行。
Grishma Patel是颇尔(Pall)生物技术的工艺开发业务(PDS)团队的高级科学家。她拥有细胞分子与生物学理学硕士学位,在贴壁细胞培养工艺放大领域拥有10多年的经验。在闲暇时间,Grishma乐于与家人共度时光、玩棋盘游戏和旅行。
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